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WB 實驗操作步驟

轉自 市場部 CST博士互助平臺

 對于蛋白質印跡法,將膜與使用 5% w/v BSA 或脫脂奶粉的 1X TBS0.1% Tween? 20稀釋的一抗在 4°C 下孵育過夜,同時輕輕振搖。

使用 Cell Signaling Technology 蛋白質印跡法實驗步驟的理由

:如需了解我們推薦的一抗稀釋緩沖液和抗體稀釋度,請參閱一抗數據表或產品網頁。

A. 溶液和試劑

從樣品制備到檢測,您進行蛋白質印跡法時所需要的試劑現均包含在一個便利的試劑盒中:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

了解我們的溶液與試劑

:利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水制備溶液。

1.    20 X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)( #9808) 為了制備 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 950 ml dH2O,然后將其混勻。

2.    10X Tris 鹽緩沖液 (TBS)( #12498) 要制備 1 L 1X TBS:向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X,然后混勻。

3.    1X SDS 樣品緩沖液Blue Loading Pack (#77227723) Red Loading Pack (#) ;通過添加 1/10 體積的 30 X DTT 1 體積的 3 X SDS 上樣緩沖液,制備新鮮的 3 X 還原上樣緩沖液。用 dH2O 將其稀釋至 1X

4.    10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液( #4050) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液:向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 電泳緩沖液,然后混勻。

5.    10X Tris-Glycine 轉移緩沖液( #12539) 要制備 1 L 1X 轉移緩沖液:向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 轉移緩沖液,然后混勻。

6.    10X Tris Buffered Saline with Tween? 20 (TBST)( #9997) 要制備 1 L 1X TBST:向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST,然后混勻。

7.    脫脂奶粉(#9999)

8.    封閉緩沖液:含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST;要制備 150 ml,向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脫脂奶粉并充分混勻。

9.    洗滌緩沖液(#9997) 1X TBST

10. 牛血清白蛋白 (BSA)(#9998)

11. 一抗稀釋緩沖液:如一抗數據表上所示,含 5% BSA 5% 脫脂奶粉的 1X TBST;要制備 20 ml,向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脫脂奶粉并充分混勻。

12. 生物素化的蛋白分子量標準品檢測包(#7727)

13. 預染蛋白質標準品,寬范圍 (11-190 kDa)(#13953)

14. 印跡膜和紙(#12369) 本實驗步驟已針對硝酸纖維素膜進行了優化。通常推薦 0.2 μm 孔徑。

15. HRP 偶聯二抗:抗兔 (#7074);抗小鼠(#7076)

16. 檢測試劑LumiGLO?化學發光試劑和過氧化物 (#7003) SignalFire? ECL Reagent (#6883)

 

B. 蛋白質印跡

制備樣品的常規流程。

樣品制備、SDS-PAGE 和轉移

1.    添加含有調節分子的新鮮培養基,使其在預定的時間內對細胞進行處理。

2.    從培養物中吸出培養基;用 1X PBS 洗滌細胞;吸出。

3.    加入 1X SDS 樣品緩沖液裂解細胞(6 孔板每孔加 100 μl 或直徑為 10 cm 盤中加 500 μl)。立即從板上刮下細胞并將提取物轉移至微量離心管。置于冰上。

4.    超聲處理 10–15 秒以完成細胞裂解并剪切 DNA(以降低樣品粘度)。

5.    20 μl 樣品,在 95–100°C 下加熱 5 分鐘;放在冰上冷卻。

6.    微量離心機內離心 5 分鐘。

7.    20 μl 上樣到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。

:建議將預染蛋白分子量標準品(#139535 μl/泳道)上樣以驗證電轉移和將生物素化的蛋白質分子量標準品 (#772710 μl/泳道)上樣以確定分子量。

8.    電轉移至硝酸纖維素膜 (#12369)

 

C. 膜封閉和抗體孵育

封閉和抗體孵育

:以下所用試劑體積數適用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;對于不同尺寸的膜,請相應調整體積。

I. 膜封閉

1.    (可選)轉移之后,在室溫下用 25 ml TBS 將硝酸纖維素膜洗滌 5 分鐘。

2.    將膜置于 25 ml 封閉緩沖液中,在室溫下孵育 1 小時。

3.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

II.一抗孵育

根據所使用的一抗,繼續下述其中一項的具體步驟。

對于無偶聯的一抗

1.    將膜和一抗(按照產品數據表中建議的適當稀釋度和稀釋液)置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

3.    按一抗來源選取合適的 HRP 偶聯的二抗(#7074  #7076,按 1:2000),同時加入anti-biotin, HRP-linked Antibody#7075 ,按 1: 1000-1:3000)以檢測生物素化的蛋白質標準品。置于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時并不時輕輕攪動。

4.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

5.    繼續進行檢測(D 部分)。

對于偶聯有HRP 的一抗

1.    將膜和一抗(按照產品數據表中建議的適當稀釋度)置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

3.    與檢測生物素酰化蛋白質標準品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075 ,按 1: 1000-1:3000)在室溫下于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時并不時輕輕攪動。

4.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

5.    繼續進行檢測(D 部分)。

對于生物素化的一抗

1.    將膜和一抗(按照產品數據表中建議的適當稀釋度)置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

3.    將膜與 Streptavidin-HRP #3999 以適宜的稀釋度)在室溫下于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時并不時輕輕晃動。

4.    5 ml TBST 洗滌三次,每次 15 分鐘。

5.    繼續進行檢測(D 部分)。

請勿加入用于檢測生物素化蛋白標準品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。沒有必要。Streptavidin-HRP 也將會使生物素化標準品可視化。

 

D. 蛋白質檢測

蛋白質檢測

1.    將膜與 10 ml LumiGLO?0.5 ml 20X LumiGLO? #70030.5 ml 20X 過氧化物和 9.0 ml 凈化水)或 10 ml SignalFire? #68835 ml 試劑 A5 ml 試劑 B)在室溫下孵育1 分鐘并不時輕輕攪動。

2.    將膜上多余的顯影液瀝干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射線膠片曝光。從剛開始的 10 秒曝光時間中可以看出適當的曝光時間。

:由于檢測反應的動力學特征,在孵育后信號立即變得最強,但在隨后的 2 小時內會減弱。


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