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Flow 實驗操作步驟

流式細胞術方案

轉自CST中國 CST博士互助平臺

 

A.     所需溶液和試劑

1. 1X磷酸鹽緩沖液(PBS):8 g氯化鈉(NaCl),0.2 g 氯化鉀(KCl),1.44 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4),0.24 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶解在800 ml蒸餾水(dH2O)中。用鹽酸調節pH7.4,定容至1升。室溫保存。

3. 甲醛溶液(無甲醇的)

4. 孵育緩沖液:0.5 g牛血清白蛋白(bovine serum albuminBSA)溶解在100 ml1 X PBS中。保存在4°C

 

B.      固定

1. 離心收集細胞,棄上清。

2. 將細胞重懸在0.5-1 ml PBS中。加入甲醛溶液至終濃度為2-4%

3. 37°C固定10分鐘。

4. 放在冰上降溫1分鐘。

5. 做細胞外染色不需要細胞膜打孔時,繼續D1步或將細胞保存在4°C含有0.1%疊氮鈉的PBS中;做細胞內染色時,繼續C1步給細胞膜打孔。

 

C.     細胞膜打孔

1. 邊輕輕震蕩邊將冰冷的100%甲醇緩慢加入到預冷的細胞中,至終濃度為90%。或者也可以在細胞膜打孔前離心去除固定劑,然后將細胞沉淀重懸在90%甲醇PBS溶液中。

2. 在冰上放置30分鐘。

3. 進入染色步驟或是將細胞在90%甲醇PBS溶液中,-20°C保存。

 

D.     免疫染色

注意:單克隆抗體設立相應亞型的對照,而多克隆抗體需要對應種屬的IgG作為對照。用血球計數法或是其他方法對細胞計數。

1. 0.5-1 x 106個細胞分到各檢測管中(依照體積)。

2. 各管加入2-3 ml孵育緩沖液漂洗,離心回收細胞。重復一次。

3. 將每個管中的細胞重懸在100 μl孵育緩沖液中。

4. 室溫,孵育緩沖液封閉10分鐘。

5. 按合適的稀釋比例在檢測管中加入未標記,生物素標記或是熒光素標記的一抗。具體的用量參考抗體各自的說明書。

6. 室溫孵育1小時。

7. 同第二步,用孵育緩沖液清洗,離心回收細胞。

8. 如果是熒光素標記的一抗,則將細胞重懸在0.5 ml PBS中然后用流式細胞儀檢測。如果是未標記或者生物素標記的一抗,則繼續D9步。

9. 用孵育緩沖液按推薦比例稀釋熒光素標記的二抗或抗生物素蛋白avidin,將細胞重懸在該稀釋液中。

10. 室溫孵育30分鐘。離心去除稀釋液。

11. 同第二步,用孵育緩沖液清洗,離心回收細胞。

12. 將細胞重懸在0.5ml PBS中然后用流式細胞儀檢測。或者繼續E1DNA染色。

 

E.      DNA染色(可選)

1. 將細胞重懸在0.5 ml DNA染色液中(例如 DRAQ5? #4084)。

2. 室溫至少孵育5分鐘。

3. 流式細胞儀進行分析。



*推薦的二抗:

抗兔:

1. Anti-Rabbit IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 488 Conjugate #4412

2. Anti-Rabbit IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 555 Conjugate #4413

3. Anti-Rabbit IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 647 Conjugate #4414

抗小鼠:

1. Anti-Mouse IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 488 Conjugate #4408

2. Anti-Mouse IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 555 Conjugate #4409

3. Anti-Mouse IgG H+L), Fab'2 Fragment Alexa Fluor? 647 Conjugate #4410

抗大鼠:

1. Anti-Rat IgG H+L), Alexa Fluor? 488 Conjugate #4416

2. Anti-Rat IgG H+L), Alexa Fluor? 555 Conjugate #4417

3. Anti-Rat IgG H+L), Alexa Fluor? 647 Conjugate #4418


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