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ChIP 實驗操作步驟--針對#9002 ChIP酶解(瓊脂糖微珠)實驗步驟-細胞

“酶”處理染色質免疫沉淀(瓊脂糖微珠)操作方法

轉自CST 中國 CST博士互助平臺

所需試劑

包含在試劑盒SimpleChIP? Enzymatic Chromatin IPKit (Agarose Beads)#9002:中的試劑:

a.    甘氨酸溶液(10X)#7005

b.    緩沖液 A(4X) #7006

c.    緩沖液 B(4X) #7007

d.    ChIP緩沖液(10X) #7008

e.    ChIP 洗脫(緩沖)液(2X) #7009

f.     5 M NaCl#7010

g.    0.5 M EDTA#7011

h.    ChIP級蛋白G瓊脂糖微珠 #9007

i.      DNA結合緩沖液#10007

j.      DNA漂洗緩沖液(使用前添加4倍體積無水乙醇)#10008

k.     DNA洗脫緩沖液#10009

l.      DNA純化柱#1001036個

m.  蛋白酶抑制劑混合物 PIC(200X) #7012

n.    RNase A (10 mg/ml) #7013

o.    微球菌核酸酶(2000 gel units/μl) #10011(用來切割染色質的關鍵酶)

p.    蛋白酶K(20 mg/ml)#10012

q. SimpleChIP? 人 RPL30(Exon 3)陽性對照引物#7014

r. SimpleChIP? 小鼠 RPL30 (Intron 2)陽性對照引物#7015

s.     組蛋白H3(D2B12) XP? 兔單抗 (ChIP 專用) #4620

t.     正常兔IgG#2729

u.    #7016,DTT粉末,192.8mg,(4°C保存,溶解后-20°C保存)

不包含在試劑盒SimpleChIP? Enzymatic ChromatinIP Kit (Agarose Beads)#9002:中的試劑:

a.    甲醛(37%)(福爾馬林)

b.    乙醇(96-100%)

c.    1X PBS #9872

d.    無核酸酶水 #12931

e.    Taq DNA聚合酶

f.     dNTP 混合液

 

I.      細胞交聯和樣品制備

為了獲得最優的ChIP結果,一個標準的ChIP反應需要約4X 106個細胞處理后獲得的染色質,以Hela細胞為例, 375px培養皿,90%生長密度下的細胞量約為8X 106個細胞。在實際工作當中,我們建議每次實驗處理足量的細胞用于滿足后續多個免疫沉淀反應(如使用不同靶標蛋白抗體進行免疫沉淀,陰性對照(IgG)組,陽性對照組等)和技術性重復要求。您可根據自己的實驗設計,在開始實驗前計算所需要的ChIP反應次數,培養相應足量的細胞。例如,對于一個標準體系的單次ChIP實驗(包括1個實驗組樣品和1個對照組樣品,分別進行1個目的蛋白抗體,陰性對照IgG,陽性對照H3抗體的3個ChIP反應)。因此,以Hela細胞樣品為例,如下表所示:


對照組                  

實驗組

目的蛋白抗體

4X 106個細胞

4X 106個細胞

陰性對照IgG

4X 106個細胞

4X 106個細胞

陽性對照H3

4X 106個細胞

4X 106個細胞

所需細胞數

1.2X 107個細胞

1.2X 107個細胞

注意:建議在開展正式實驗前,先進行下預實驗,以熟悉實驗體系和了解并優化所用樣本的各項條件。預實驗時,需要額外準備一個細胞樣品,對染色質樣品酶解效率和濃度進行檢測(參照第III部分)。

另外,為了細胞計數,可另外準備一盤細胞用于血球計數板法測定細胞數。

實驗前準備

·         足量培養的細胞(請根據自己的實驗需求,計算所需要的ChIP反應次數和培養細胞量)

·         取出并預熱200X蛋白酶抑制劑混合物PIC#7012和10X 甘氨酸溶液#7005,確保PIC完全溶解。

·         配制1M DTT溶液。192.8 mg DTT #7016+1.12ml dH2O,確保DTT完全溶解。

注意:一旦配好DTT溶液,請保存于-20°C。

·         準備預冷的PBS,用于洗滌細胞。

·         配制含PIC的PBS,用于刮下和收集細胞。每15 cm培養皿需要2ml PBS(加入10μl 200X PIC) ,置于冰上冷卻。

1.    為了使蛋白與DNA交聯,向每個含有20 ml培養基的375px培養皿中加入540 μl 37%的甲醛溶液(可根據培養基體積調整,保證甲醛終濃度為1%即可)。稍加轉動培養皿使之混勻,室溫放置10分鐘。加入甲醛后,培養基的顏色會發生改變。

2.    每15 cm培養皿中中加入2 ml 10X甘氨酸溶液稍加轉動使之混勻,室溫孵育5分鐘,來終止上述固定反應。加入甘氨酸后,培養基的顏色會發生改變。

3.    對于懸浮細胞,收集固定后的細胞到50 ml錐底管中,4°C1500rpm離心5分鐘沉淀細胞后,用冰冷的PBS漂洗兩次(20 ml /次)。去除上清后立即進行后續的細胞核處理和染色質酶解(見第II部分)。

4.    對于貼壁細胞,棄去培養基后用冰冷的普通PBS漂洗兩次(20 ml/次),每次徹底棄凈PBS。

5.    每15 cm培養皿的細胞量中加入2 ml冰冷的含PIC的1X PBS,將細胞刮下,并將所有固定后的細胞收集到一個15 ml的錐底管中。

6.    4°C,1500rpm離心5分鐘收集細胞,去除上清后立即進行后續的細胞核處理和染色質剪切(參照第II部分)。

 

II.     細胞核處理和染色質剪切

注意:以下的操作流程所需的試劑用量是針對單個IP反應(每4X 106細胞)給出所需試劑用量。我們建議,同一樣品組內的多管樣品(用于不同抗體的ChIP沉淀反應需要)染色質處理過程可合并至一管進行,這有利于得到均一的染色質酶解和超聲效果,使用者需根據每組需要的ChIP反應總數調整試劑用量。

實驗開始前準備:

·         取出并預熱200X蛋白酶抑制劑混合物PIC#7012,確保PIC完全溶解。

·         1 M DTT(192.8 mg DTT #7016 + 1.12ml dH2O),確保DTT完全溶解(溶解后-20°C 保存)。

·         預熱10X ChIP緩沖液#7008,確保其中SDS完全溶解。

針對單個IP反應,準備如下試劑:

·         每4X 106細胞,準備100 μl 1XChIP 緩沖液 (10 μl 10X ChIP 緩沖液#7008+ 90 μl 水) + 0.5 μl 200X 蛋白酶抑制劑混合物 (PIC),冰上預冷。

·         每4X 106細胞,準備1 ml 1X 緩沖液A(250 μl 4X緩沖液A #7006+750μl 水)+ 0.5 μl 1 M DTT + 5 μl 200X蛋白酶抑制劑混合物(PIC),冰上預冷。

·         每4X 106細胞,準備1.1 ml 1X 緩沖液B(275 μl 4X緩沖液B#7007+ 825μl 水)+ 0.55 μl 1 M DTT,冰上預冷。緩沖液B中切勿加入PIC。

1.        每4X 106細胞重懸到預冷的1 ml 1X緩沖液 A + DTT + PIC中,冰上孵育10分鐘,每3分鐘顛倒混勻一次。

2.        4°C 3000rpm離心5分鐘以沉淀細胞核。棄上清,每4X 106細胞的沉淀重懸在1 ml冰冷的緩沖液B + DTT中。再次離心,棄上清,并將沉淀用100 μl 緩沖液 B + DTT再次重懸(此時同一樣品組內的多管樣品可合并至一管一起進行后續的酶解,超聲處理,將同組樣品轉移到一個新的1.5 ml離心管中)。

3.        加入適量(一般起始量為0.5ul/每4X 106細胞)微球菌核酸酶,顛倒混勻數次,37°C孵育20 min,每隔3~5分鐘顛倒混勻一次,將DNA消化成長度約為150-900 bp的片段。

注意:可通過預實驗確定將不同細胞系DNA酶切到理想長度所需微球菌核酸酶的酶量(參照附錄A),其中4 ×106個HeLa細胞核經0.5 μl微球菌核酸酶#10011消化可以得到合適長度的DNA片段。

4.        每4X 106細胞,加入10 μl 0.5M EDTA終止消化,將離心管置于冰上。

5.        4°C 13000rpm離心1分鐘,沉淀細胞核。棄上清。

6.       每4X 106細胞的沉淀重懸在100 μl 1XChIP 緩沖液 + PIC中,冰上孵育10分鐘。 可用帶有剪去前端部分的槍頭的移液器吹打均勻。

7.        對細胞核樣品用超聲波處理數次以破碎核膜(將合并后的同組樣品超聲體積控制在500 μl左右,若原體積不足500ul,可用1X ChIP 緩沖液補足到500ul,可獲得最優的超聲效果)。CST推薦使用最大功率為100W左右的超聲破碎儀進行超聲處理,使用3mm的探頭,設置超聲功率為最大功率的30%-40%,對細胞核進行每次20秒,共3次(累計60秒超聲)的超聲處理以達到完全破碎的效果。每次超聲處理間隔30秒并置于冰上以防止超聲引起樣品過熱。另外,可以在超聲前后分別把細胞核懸液滴于載玻片上,用蓋玻片封片后利用光學顯微鏡觀察細胞核以判斷完全破碎細胞核所需的最佳條件。或者也可以用杜恩斯型(Dounce)勻漿器處理細胞核20次,但是這種破碎效果可能不如超聲處理完全。

8.        4°C 10000rpm離心10分鐘,除去樣品中的細胞核碎片。

9.        將上清轉移到一個新管子中,即為交聯的染色質樣品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 μl染色質樣品用以分析DNA的酶切情況并確定其濃度(參照第III部分)。



III.    分析染色質的濃度和酶切情況(推薦步驟)

1.        向50 μl染色質樣品(來自第I部分第9步)添加100 μl無核酸酶的水,補足到150ul,然后加入6 μl 5 M NaCl #7010和 2 μl RNase A #7013。渦旋震蕩混勻,37°C孵育30分鐘。

2.        向RNase A消化后的樣品中加入2 μl 蛋白酶K。渦旋震蕩混勻, 65°C孵育2小時。

3.        按照第VI部分的說明利用離心柱純化DNA。

4.        DNA樣品純化后,取15 μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳(使用100 bp DNA ladder作為Marker)以確定DNA片段大小。DNA應當被酶切成長度約為150-900 bp的片段(1~5個核小體長度)

5.        測定DNA濃度時,將2 μl純化后的DNA加入到98 μl TE緩沖液中(即稀釋50倍),然后讀取并記錄DNA濃度。并乘以50來計算原管中的DNA濃度,理想的DNA濃度應當在50~200 μg/ml之間。

注意:要得到理想的ChIP結果,合適長度和濃度的染色質樣品至關重要。過度消化可能會減弱PCR定量信號。而消化不足可能會導致過高的背景信號并降低分辨率。加入到IP體系中的染色質太少也可能導致不能產生PCR定量信號。優化染色質消化條件的操作方法請參照附錄A。



IV.   染色質免疫沉淀

為了得到理想的ChIP結果,每個IP反應需要含有5-10 μg DNA的交聯染色質片段。一般在與抗體孵育前,需要根據樣品染色質濃度計算體積后分至新的不同EP管中,并分別用1X ChIP緩沖液補齊到500 μl。

實驗開始之前準備:

·         取出并預熱200X蛋白酶抑制劑混合物PIC#7012。確保PIC完全溶解。

·         預熱10X ChIP緩沖液#7008,確保其中SDS完全溶解。

·         交聯的染色質樣品(取自第II部分第9步)

·         低鹽漂洗液:每個IP反應預備 3 ml 1X ChIP 緩沖液 (300 μl 10X ChIP 緩沖液 + 2.7 ml 水),使用前室溫保存。

·         高鹽漂洗液:每個IP反應預備1 ml 1X ChIP 緩沖液 (100 μl 10X ChIP 緩沖液 + 900 μl 水) + 70 μl 5M NaCl #7010,使用前室溫保存。

1.        在確定免疫反應數時,每一個組內應考慮計算包括目的蛋白抗體管(可能為多種不同目的蛋白抗體,根據抗體種類數確定)和陰性對照管抗體正常兔IgG #2729的反應數。同時,對于初次進行ChIP實驗的用戶,我們推薦每組加一個陽性對照管,后續使用試劑盒內提供的#4620抗體進行ChIP反應。

2.        在配好的ChIP緩沖液中,每個反應管加入等量交聯后的染色質樣品(每管對應5~10ug的染色質DNA,來自第II部分第9步),每個沉淀反應需要用1X ChIP緩沖液補齊到500 μl(需要補加的體積根據每管分裝的染色質體積確定),并補加適量的200X PIC,混勻后置于冰上。

3.        將稀釋后的ChIP染色質,每個樣品管吸取10 μl樣品并轉移到一個新的離心管中,作為2%樣品輸入對照(Input),在后續使用之前可以保存在-20°C (Input樣品后續用于第V部分的第1步)。

4.        在各個樣品管中加入對應的目的蛋白抗體,在每組陰性對照管中加入IgG。每種抗體做免疫沉淀時所需用量在1~2 μg,具體濃度請聯系CST技術支持查詢,并需要和陰性對照正常兔IgG #2729抗體用量保持一致。IgG濃度較高,加入1~2ul即可。對于本試劑盒自帶陽性對照組蛋白H3 (D2B12) XP? 兔單抗#4620,加入10 μl即可。將加入抗體的反應管封嚴,在4°C的轉子上孵育4小時以上或過夜。

5.        輕微重懸混勻ChIP級蛋白G瓊脂糖微珠 #9007,取30 μl加入到每個免疫沉淀反應中,重新封嚴管子,4°C的轉子上孵育2小時。為了防止在吸取微珠時槍頭將微珠損傷,可以在吸取微珠前將100ul槍頭用剪刀減去前端一小部分使用。注意:ChIP級蛋白G瓊脂糖微珠 #9007因存在鮭精DNA封閉問題,故不適用于后續ChIP-Seq檢測。

6.        4°C 6000rpm,離心1分鐘,沉淀每個樣品中的蛋白G瓊脂糖微球,并除去上清。此上清可以暫時保留,以備查找問題時使用。

7.        加入1ml低鹽漂洗液,在4°C轉子上轉動并孵育5分鐘。再重復上述6和7步驟2次,即總共用低鹽漂洗液洗3次。

8.        加入1ml高鹽漂洗液,在4°C轉子上轉動并孵育5分鐘。然后小心地將上清吸走,然后立即進入第V部分。

 

V.     將染色體從抗體/蛋白G微珠上洗脫并解交聯

實驗開始之前準備:

·         從冰箱中取出并在37°C水浴中預熱2 X ChIP洗脫緩沖液#7009并確認SDS已完全溶解。

·         將水浴鍋或溫控混勻器設定到65°C。

·         為各個樣品管(包括陰性對照IgG管)洗脫下來的樣品和2%的樣品輸入對照(2% Input)準備1 X ChIP洗脫緩沖液。每管需要75 μl 2 X ChIP洗脫緩沖液#7009 + 75 μl 水,需要的1 X ChIP洗脫緩沖液總量依據總管數+input數來計算。

以下步驟均針對每個樣品管來描述:

1.        取150 μl 1 X ChIP洗脫緩沖液分別加入到每組對應的2%樣品輸入對照(2% Input)管中,室溫放置直到第6步。

2.        在其他每份ChIP免疫沉淀樣品中分別加入150 μl 1 XChIP 洗脫緩沖液。

3.        用渦旋混合器輕輕震蕩(1200rpm),65°C孵育30分鐘將染色質從抗體/蛋白G微球上洗脫下來。此步用金屬溫控振蕩器(即帶有振蕩功能的金屬浴)效果最好。當然,洗脫也可以在室溫下的轉子上進行,但洗脫效果可能不如溫控振蕩器完全。

4.        4°C 6000rpm,離心1分鐘,沉淀每個樣品中的蛋白G瓊脂糖微球,并除去上清。

5.        小心地將每個樣品管中洗脫下來的染色質上清轉移到一個新的離心管中,并分別標記。

6.        在所有管中,包括第一步的2%樣品輸入對照(2% Input)管,都加入6 μl 5 M NaCl和2 μl 蛋白酶K#10012并在65°C孵育2小時。

7.        可直接進入第VI部分,或者可保存樣品在-20°C,暫停操作。為了避免在低溫形成沉淀,在第VI部分第一步開始添加DNA結合液前,需確保樣品回復室溫。



VI.   離心柱純化DNA

實驗開始之前準備:

·         向DNA漂洗緩沖液#10008添加4倍體積的96-100%乙醇。

·         為V部分得到的每一個DNA樣品準備一套DNA離心柱和收集管。

1.        向每個DNA樣品中添加750 μl DNA結合緩沖液#10007,渦旋混勻器稍加震蕩。即每一份的樣品需要添加五倍體積的DNA結合緩沖液。

2.        將DNA離心柱插入到收集管中并做標記,每個樣品先吸取450 μl分別轉移到各自的離心柱中。

3.        室溫14000rpm離心30秒。

4.        把離心柱從收集管中取出,倒掉廢液后,將離心柱重新插回到收集管中。

5.        將第1步中剩余的450 μl樣品再轉移到相應的離心柱中,重復第3和第4步。

6.        在每個離心柱中加入750 μl的DNA漂洗緩沖液#10008。

7.        14000rpm離心30秒。

8.        把離心柱從收集管中取出,倒掉廢液。將離心柱插回到收集管中。

9.        14000rpm離心30秒。

10.      取出每個樣品對應的離心柱,分別插入到一個干凈的1.5 ml離心管中,并做好標記,將收集管和廢液一起丟棄。

11.      在每個離心柱中加入50 μl DNA 洗脫緩沖液#10009,室溫靜置2分鐘。

12.      14000rpm離心30秒,洗脫DNA。

13.      將每個管子中的DNA離心柱取出并丟棄,離心管中的洗脫液即為純化的DNA。樣品可立即使用或保存在-20°C。



VII.   用PCR定量進行ChIP富集效率的分析

建議:

·         實驗中使用帶濾芯的槍頭以盡可能減少污染的可能性。

·         試劑盒中所包含的對照引物特異性識別人或小鼠的RPL30基因(#7014+ #7015),既可以用于常規PCR也可以用于實時定量PCR。如果用戶做的ChIP樣品來源于其它他物種,建議客戶設計合適的特異對照引物并優化PCR反應條件。

·         建議使用熱啟動Taq聚合酶以減少產生非特異PCR產物的風險。

·         PCR引物的選擇很關鍵。引物應盡可能按照下列標準來設計:

 

 

引物長度:

24個核苷酸

最佳Tm值:

60°C

最佳GC含量:

50%

擴增片段長度:

150-200 bp(用于常規PCR)   80-160 bp (用于實時定量PCR)

 

常規PCR操作:

1.        按樣品數取出合適數目的0.2 ml PCR管并做好標記。注意包括2%樣品輸入對照(Input)組,陽性對照(組蛋白H3樣品)組,陰性對照(正常兔IgG樣品)組,以及一個監控DNA污染的無DNA模板的空白組對照。

2.        在每管中加入2μl各自對應的DNA樣品作為模板,即Input組需要加入稀釋后的input DNA樣品作為模板,而其他反應管需要按照實驗設計的分組加入對應的ChIP沉淀后獲得的DNA作為模板。

3.        按下面配方配制PCR反應液總管,記住計算時多算兩份以補償分管時的體積損失。配好后,向每個PCR管中加入18μl反應液混合物。

試劑

每個PCR反應(18    μl)所需體積

無核酸酶的水

12.5 μl

10X PCR 緩沖液

2.0 μl

4 mM dNTP混合液

1.0 μl

5 μM RPL30引物

2.0 μl

Taq DNA聚合酶

0.5 μl

4.        設定并執行以下PCR反應程序:

a.

預變性

95°C

分鐘

b.

變性

95°C

30 

c.

退火

62°C

30

d.

延伸

72°C

30

e.

重復b~d步,共34個循環



f.

終末延伸

72°C

分鐘

5.        從每個反應管中取10 μl PCR產物,2%瓊脂糖凝膠或10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,用100 bp DNA Marker做對照。人、小鼠RPL30的PCR產物大小分別為161和159 bp。

 

實時定量PCR方法:

1.        選與所用定量PCR儀配套的PCR管或板,做好標記。注意加入陽性對照組蛋白H3樣品組,陰性對照正常兔IgG樣品組,以及監控DNA污染的不加DNA模板的空白組對照。另外在加入反應體系前,將2%樣品輸入對照(input)DNA做一系列稀釋(無稀釋,1:5稀釋,1:25稀釋,1:125稀釋),據此可以產生標準曲線并測算PCR擴增效率。

2.        在每個反應管或孔(板上)中均加入2 μl相應DNA模板。即Input組需要加入不同稀釋后的input DNA樣品作為模板,而其他反應管需要按照實驗設計的分組加入對應的ChIP沉淀后獲得的DNA作為模板。

3.        按下面配方配制PCR反應液總管,記住計算時多算兩份以補償分管時的體積損失。配好后,向每個PCR管中加入18 μl反應液混合物。

試劑

每個PCR反應(18    μl)所需體積

無核酸酶的水

6 μl

5 μM RPL30 引物

2 μl

SYBR-Green反應體系

10 μl

4.        按下面程序執行PCR:

a.

預變性

95°C 3 分鐘

b.

變性

95°C 10 秒

c.

退火及延伸:

60°C 30 秒

d.

重復第2及第3步,共40個循環


5.        用定量PCR儀自帶的程序分析定量結果。并利用下列公式,根據每管Ct值進行ChIP富集效率的計算。

Enrichment percentage=2%×2(C[T] Input Sample – C[T] IP Sample

C[T] = CT =Threshold cycle of PCR reaction

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